TOPO-клонирование

Обзор технологии TOPO®

В 2001 году компания Invitrogen разработала революционную технологию быстрого эффективного клонирования TOPO®. Сейчас TOPO® является наиболее широко используемой методикой клонирования в мире.

Подробнее>>

Преимущества:

  • Доля целевых клонов – 95%;
  • Время реакции – 5 минут при комнатной температуре;
  • Все необходимые реагенты включены в набор;
  • Проверенная методика: более 4 000 цитирований;
  • Возможность выбора наиболее подходящих компетентных клеток;
  • Простой протокол.

Принцип клонирования TOPO®

Топоизомераза I

Основа метода – реакция в присутствии топоизомеразы I, выполняющей роль одновременно эндонуклеазы рестрикции и лигазы. Биологическая роль этого фермента – релаксация сверхскрученной кольцевой молекулы ДНК во время репликации путём её разрезания и последующего сшивания. Топоизомераза I вируса коровьей оспы специфически распознаёт последовательность (C/T)CCTT и образует ковалентную связь с 3´-тимидином, внося одноцепочечный разрыв в ДНК. Разрыв обеспечивает свободное вращение одной цепи ДНК относительно другой и релаксацию спирали. После этого топоизомераза I сшивает концы разрезанной цепи обратно, разрывая связь с 3´-тимидином, и высвобождается.

Векторы TOPO®

Векторы TOPO® поставляются в линеаризованном виде с пришитой к каждому 3´-фосфату топоизомеразой I для использования её лигазной активности. Это позволяет быстро (всего за 5 минут) сшить вектор с совместимыми концами клонируемого фрагмента ДНК (вставки).

Механизмы клонирования

  • TOPO® TA – комплементарное спаривание 3´-T вектора и 3´-A продукта ПЦР с ДНК-полимеразой Taq с последующим лигированием;
  • Клонирование по тупым концам Zero Blunt® TOPO® – сшивание вектора с продуктом ПЦР по тупым концам, приводящее к разрыву летального гена ccdB;
  • Направленное клонирование Directional TOPO® – встраивание фрагмента ДНК в вектор в нужной ориентации. Вектор имеет один выступающий 5´-конец (GGTG), а один из концов вставки достраивают комплементарной последовательностью (CACC).

Компетентные клетки, входящие в состав наборов TOPO®

Наборы TOPO® производятся в нескольких модификациях, различающихся включёнными в состав компетентными клетками. С 2012 года выпускаются также наборы без компетентных клеток.

Основные марки компетентных клеток

  • One Shot® – удобный формат фасовки клеток: одна пробирка – одна трансформация;
  • MAX Efficiency® – марка клеток с высокой эффективностью трансформации (108–109 КОЕ/мкг и более). Такие клетки пригодны для клонирования малых количеств ДНК и ПЦР-клонирования;
  • T1R – клетки, устойчивые к фагам T1 и T5.

Компетентные клетки E. coli для клонирования

Все перечисленные штаммы имеют эффективность трансформации не менее 109 КОЕ/мкг.

  • Химически компетентные клетки:
    • One Shot® MAX Efficiency® DH5α™-T1R – клетки-производные штамма DH5α™. Как и исходный штамм, эти клетки поддерживают трансформацию неметилированной ДНК (продукты ПЦР) и бело-голубую селекцию, а также сниженный уровень неспецифического гидролиза и рекомбинации ДНК. Эффективность трансформации – не менее 109 КОЕ/мкг;
    • One Shot® Mach1™-T1R – в дополнение ко всем упомянутым достоинствам DH5α™-T1R являются самым быстрорастущим штаммом компетентных клеток: время удвоения всего 50 мин (в 1,5 раза короче, чем у большинства штаммов, используемых в клонировании). Это позволяет перейти от ночной колонии к выделению плазмиды всего за 4 часа. Наборы TOPO® с клетками Mach1™ позволяют сэкономить до 2 дней по сравнению с традиционным методом на основе эндонуклеаз рестрикции;
    • One Shot® TOP10 — поддерживают эффективную трансформацию как неметилированной, так и метилированной ДНК (фрагменты геномной ДНК). По генотипу близки к штамму DH10B™;
    • One Shot® TOP10F´ – TOP10 с F´-эписомой для продукции одноцепочечной ДНК.
  • Электрокомпетентные клетки:
    • One Shot® TOP10 Electrocomp™ – TOP10, трансформирующиеся электропорацией.

Ниже представлена небольшая выборка наборов TOPO®. Ознакомиться с ассортиментом TOPO® более полно помогут Обзор областей применения наборов TOPO® и Руководство по выбору векторов Life Technologies.

картинка Набор TOPO® TA Cloning® Dual Promoter от магазина Helicon
Набор TOPO® TA Cloning® Dual Promoter

20 реакций

K460001

$1,387 89 860.40 р. 89 860.40 р.

картинка Набор TOPO® TA Cloning® для секвенирования; без компетентных клеток от магазина Helicon

20 реакций

450030

$698.24 45 237.29 р. 45 237.29 р.

картинка Набор TOPO™ XL-2 для клонирования длинных ПЦР-продуктов; с One Shot™ OmniMAX™ 2 T1R и с химически-компетентными клетками от магазина Helicon

10 реакций

K805010

Цена по запросу

картинка Набор для ПЦР-клонирования Zero Blunt® TOPO®; без компетентных клеток от магазина Helicon

20 реакций

450245

$740.89 48 000.48 р. 48 000.48 р.

картинка Набор TOPO® TA Cloning®; без компетентных клеток от магазина Helicon
Набор TOPO® TA Cloning®; без компетентных клеток

20 реакций

450641

$698.24 45 237.29 р. 45 237.29 р.

20 реакций

K10001

$1,620.80 105 007.74 р. 105 007.74 р.

Набор pcDNA™3.3-TOPO® TA Cloning®

20 реакций

K830001

$2,337.99 151 472.76 р. 151 472.76 р.

Набор для клонирования pCR®8/GW/TOPO® TA

20 реакций

K250020

$1,544.97 100 094.90 р. 100 094.90 р.

Набор для экспрессии pcDNA™3.2/GW/D-TOPO®

20 реакций

K244020

$1,835.64 118 926.71 р. 118 926.71 р.

Набор для экспрессии pcDNA™3.1/V5-His TOPO® TA

20 реакций

K480001

$1,412.27 91 497.58 р. 91 497.58 р.

 

K495000

$6,216.22 402 733.97 р. 402 733.97 р.

20 реакций

K240020

$1,627.12 105 417.20 р. 105 417.20 р.