Fermentas. Эндонуклеазы рестрикции как компоненты систем рестрикции-модификации ДНК.


Общая характеристика систем рестрикции-модификации

Первая ферментативная система рестрикции и модификации ДНК была открыта в 1953 г. С.Луриа, Г.Бертани и Дж. Уэйглом [1, 2] при изучении хозяйской специфичности фагов. Они обнаружили, что при заражении штамма E.coli K12 фагом лямбда клетки ограничивают («рестриктируют») размножение фага, модифицируя его. Модификация выражалась в метилировании оснований, занимающих определенное место в ДНК.

В 1962 г. Арбер и сотрудники его лаборатории [3] выявили механизм «ограничения», вызванного клеткой-«хозяином». ДНК бактериофага расщепляется на фрагменты под действием фермента эндонуклеазы рестрикции (ЭР), действующего совместно с метилтрансферазой (МТазой). Арбер назвал систему, состоящую из этих двух ферментов, системой рестрикции-модификации (Р-М). Оба фермента взаимодействуют с определенной последовательностью нуклеотидов в ДНК. Последовательность узнавания обычно состоит из 4-8 пар нуклеотидов, которые могут быть расположены непосредственно друг за другом или же на некотором расстоянии. Такая последовательность может быть симметричной или нет. Большинство ферментов узнает только двуцепочечную ДНК, однако существуют системы, для которых субстратом является одноцепочечная ДНК [4-6]. Во многих системах Р-М эндонуклеаза рестрикции и метилтрансфераза представляют собой отдельные ферменты, но в некоторых системах обе эти функции совмещены в одном мультисубъединичном белке.

Бактериальная эндонуклеаза рестрикции катализирует гидролиз ДНК. Расщепление происходит в определенных местах субстрата и представляет собой гидролиз одной фосфодиэфирной связи в каждой из цепей двутяжевой ДНК. Для многих систем Р-М расщепление ДНК ЭР происходит внутри или рядом с узнаваемой последовательностью нуклеотидов. Однако для некоторых систем Р-М характерно протекание гидролиза на неопределенном расстоянии - более 1000 пар нуклеотидов - от участка узнавания.

Кофакторами расщепления ДНК выступают ионы двухвалентных металлов, например, Mg2+. Некоторым ЭР для гидролиза необходимо присутствие АТФ или S-аденозил-L-метионина (AdoMet или SAM). При расщеплении углеводофосфатного остова ДНК происходит, как правило, образование 5’-фосфатной и 3’-гидроксильной групп. По-видимому, это объясняется тем фактом, что такое повреждение в ДНК, например, при внесении случайных одноцепочечных разрывов, легко может быть восстановлено при помощи ДНК-лигазы, тогда как лигирование фрагментов, содержащих 5’-гидроксил и 3’-фосфат, невозможно.

ЭР чрезвычайно чувствительны к метилированию последовательности узнавания. Более того, метилирование чаще всего препятствует гидролизу ДНК. Это свойство систем Р-М предохраняет ДНК бактериальной клетки от ферментативного разрушения собственной ЭР. Следует отметить, что метилирование по позициям, отличным от метилирования собственной МТазой, не всегда блокирует действие ЭР [7]. С другой стороны, метилирование даже одной цепи ДНК собственной МТазой («монометилирование») обычно достаточно для того, чтобы соответствующая ЭР не могла гидролизовать такой фрагмент ДНК.

Иногда ЭР и МТазы встречаются отдельно друг от друга, не образуя системы Р-М. Например, в Escherichia coli были обнаружены две непарные МТазы:

  • ДНК-аденин-метилтрансфераза (Dam) и
  • ДНК-цитозин-метилтрансфераза (Dcm) [8].

Наиболее известная и охарактеризованная непарная эндонуклеаза рестрикции DpnI гидролизует в двутяжевой ДНК последовательность нуклеотидов 5’-...Gm6ATC...-3’. Участок узнавания данной ЭР метилирован [9]. Отсутствие метилирования препятствует расщеплению ДНК. К другому типу непарных ЭР относятся эндонуклеазы генной конверсии («homing endonucleases»), например, I-SceI [10, 11], I-Ppo [12], I-TevI [13]. Последовательность узнавания таких эндонуклеаз является ассиметричной и достаточно протяженной (около 20 пар нуклеотидов). В результате их действия образуются фрагменты ДНК с 2-4-мя неспаренными нуклеотидами на 3’-конце [14].

В настоящее время системы Р-М найдены практически у всех исследованных бактерий. Гены, ответственные за кодирование ЭР и МТаз, могут быть локализованы в геноме бактерии-«хозяина», в плазмидах и в геноме фагов. В эукариотах системы Р-М найдены не были. Выделение большого количества эндонуклеаз рестрикции и метилтрансфераз позволило изучить их свойства, систематизировать и разработать номенклатуру и классификацию.

Номенклатура систем рестрикции-модификации

Для обозначения систем Р-М до недавнего времени было принято использовать номенклатуру, предложенную в 1973 г. Смитом и Натансом [15]. Она включает следующие правила:

  • Ферменты системы Р-М обозначают тремя латинскими буквами: первая (заглавная) буква соответствует родовому названию микроорганизма, вторая и третья - первые буквы названия вида организма, из которого выделен данный фермент. В случае, когда видовая принадлежность микроорганизма не определена, используют буквы sp. Все три буквы пишутся курсивом. Например, Eco – эндонуклеаза рестрикции, выделенная из Escherichia coli.
  • За родо-видовым названием следует типовая характеристика штамма (например, Hind обозначает фермент из клеток Haemophilus influenzae с серотипом d), либо буквенное обозначение штамма-источника фермента или музейный номер культуры: EcoK, EcoB, Bsu1076, Bsu1114, Bsu1247. Если фермент контролируется нехромосомным элементом, ставят его символ, например: EcoR - кодируется плазмидой R1, EcoP - кодируется фагом P1. Если надо обозначить и штамм, то штамм указывается в скобках - Eco(B)P.
  • Если один штамм содержит несколько разных систем Р-М, то ферменты этих систем обозначают римскими цифрами (в порядке обнаружения). Например, HaeI, HaeII, HaeIII относятся к трем разным ферментам клеток Haemophilus aegyptius.
  • Для сокращенного обозначения ЭР перед названием фермента ставится буква R, а для обозначения метилтрансфераз - М, например, R.EcoB и M.EcoB.

Предложенная система обозначений на протяжении достаточно продолжительного времени не требовала каких-либо изменений и дополнений. Однако, по мере того, как все больше и больше систем Р-М было обнаружено и охарактеризовано, возникла необходимость дополнения или изменения принятой номенклатуры. Также следовало принять во внимание появление в каждом типе эндонуклеаз дополнительного деления на подтипы. Особенно это актуально для ЭР II-го типа, которых к 2003 г. уже было известно более 3500 [16]. Поскольку эндонуклеазы генной конверсии также стали называть, следуя правилам принятой в 1973 г. системы обозначений, то их тоже необходимо было включить в классификацию. Поэтому в 2003 г. Робертсом и соавт. [17] была предложена доработанная номенклатура для обозначения ЭР, МТаз, эндонуклеаз генной конверсии и их генов.

Были внесены следующие изменения и дополнения:

  • Ферменты системы Р-М следует называть «эндонуклеазы рестрикции» (либо «фермент рестрикции», ЭР, REase) и «метилтрансферазы» (МТазы, MTase), избегая сокращенных названий «рестриктаза» и «метилаза». Для эндонуклеаз генной конверсии («homing endonuclease») допустимо использовать аббревиатуру HEase.
  • При обозначении фермента первые буквы, соответствующие видо-родовому названию организма, не следует писать курсивом.
  • Римскую нумерацию штаммов различных систем Р-М из одного микроорганизма следует писать без пробела сразу после названия фермента, например, HaeI и HaeII. Также следует избегать использования каких-либо знаков пунктуации (точек, скобок, дефисов) в названии фермента. Например, ЭР Bst4.4I надо писать как Bst44I.
  • Как и ранее, для сокращенного обозначения ЭР перед названием фермента ставится буква «R», а для обозначения метилтрансфераз – «М». Префикс «N» добавляется к ферментам, вносящим одноцепочечные разрывы в ДНК («nicking enzymes»), например, N.BstNBI. Префикс «С» добавляется к названиям производных соответствующих генов, которые являются контрольными белками («controlling proteins»), например, C.BamHI. Также возможно добавление двух букв в префиксе, например, RM.Eco57I, когда и эндонуклеазная, и метилтрансферазная активности соединены в одном белке. Для некоторых ЭР возможно инактивировать одну из субъединиц белка, в результате чего образуется ЭР, которая вносит разрыв только в одной из цепей ДНК. Такие производные следует обозначать как Nt.BbvCI и Nb.BbvCI, где t («top») соответствует гидролизу только «верхней» цепи участка узнавания, а b («bottom») – «нижней» цепи участка узнавания ЭР BbvCI.
  • Для обозначения метилированных гетероциклических оснований приняты следующие сокращения: N6-метиладенин (m6A), 5-метилцитозин (m5C) и N4-метилцитозин (m4C).
  • ЭР разных систем Р-М, узнающие одинаковые последовательности в ДНК, называются изошизомерами. Иногда этот термин применяют и к системам Р-М, ферменты которых узнают одинаковые нуклеотидные последовательности [18]. Изошизомерные ЭР, которые отличаются по месту гидролиза фосфодиэфирных связей участка узнавания, следует называть неошизомерами.

1. Bertani G., Weigle J.J. 1953. Host-controlled variation in bacterial viruses. J. Bacteriol. 65, 113–121.

2. Luria S.E., Human M.L. 1952. A nonhereditary, host-induced variation of bacterial viruses. J. Bacteriol. 64, 557-569.

3. Arber W., Dussoix D. 1962. Host specificity of DNA produced by Escherichia coli. Host controlled modification of bacteriophage lambda. J. Mol. Biol. 5, 18–36.

4. Cerritelli S., Springhorn S.S., Lacks S.A. 1989. DpnA, a methylase for single-stranded DNA in the DpnII restriction system, and its biological function. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, 9223-9227.

5. Konez C., Kiss A., Venetianer P. 1978. Biochemical characterisation of the restriction-modification system of Bacillus sphaericus. Eur. J. Biochem. 98, 523-529.

6. Wells R.D., Neuendorf S.K. 1981. Cleavage of single-stranded viral DNAs by certain restriction endonucleases. In Gene Amplification and Analysis. Ed. Chirikjian J.G. Holland: Elsevier, pp. 101-111.

7. McClelland M., Nelson M. 1988. The effect of site-specific methylation on restriction endonucleases and modification methyltransferases. Gene. 74, 291-304.

8. Marinus M.G. 1987. DNA methylation in Escherichia coli. Annu. Rev. Genet. 21, 113-131.

9. Lacks S., Greenberg B. 1977. Complementary specificity of restriction endonucleases of Diplococcus pneumoniae with respect to DNA methylation. J. Mol. Biol. 114, 153-168.

10. Colleaux L., D’Auriol L., Galibert F., Dujon B. 1988. Recognition and cleavage site of the intron-encoded omega transposase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 6022-6026.

11. Monteilhet C., Perrin A., Theirry A., Colleaux L., Dujoi B. 1990. Purification and characterization of the in vitro activity of I-Sce I, a novel and highly specific endonuclease encoded by a group I intron. Nucleic Acids Res. 18, 1407-1413.

12. Muscarella D.E., Ellison E.L., Ruoff B.M., Vogt V.M. 1990. Characterization of I-Ppo, an intron-encoded endonuclease that mediates homing of a group I intron in the ribosomal DNA of Physarum polycephalum. Moll. Cell Biol. 10, 3386-3396.

13. Quirk S.M., Bell-Pedersen D., Belfort M. 1989. Intron mobility in the T-even phages: high frequency inheritance of group I introns promoted by intron open reading frames. Cell. 56, 455-465.

14. Chu F.K., Maley G., Pedersen-Lane J., Wang A.M., Maley F. 1990. Characterization of the restriction site of a prokaryotic intron-encoded endonuclease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 3574-3578.

15. Smith H.O., Nathans D. 1973. A suggested nomenclature for bacterial host modification and restriction systems and their enzymes. J. Mol. Biol. 81, 419-423.

16. Roberts R.J., Macelis D. 2003. REBASE – restriction enzymes and methylases. Nucleic Acids Res. 31, 418-420.

17. Roberts R.J., Belford M., Bestor T., Bhagwat A.S., Bickle T.A., Bitinaite J., Blumenthal R.M., Degtyarev S.Kh., Dryden D.T.F., et al. 2003. A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and their genes. Nucleic Acids Res. 31, 1805-1812. 18. Wilson G.G., Murray N.E. 1991. Restriction and modification systems. Annu. Rev. Genet. 25, 585–627.