Электрофорез. Краткая теория.
Хотя детальная теория электрофореза достаточно сложна, основные фундаментальные принципы этого метода просты. Большинство глобулярных белков собраны таким образом, что большая часть заряженных групп, а именно гидрофильных, расположена на поверхности белка, тогда как незаряженные, гидрофобные остатки погружены во внутрь глобулы. В электрическом поле в соответствии со своим зарядом белки мигрируют по направлению к противоположно заряженному электроду.
Подвижность заряженных частиц может быть представлена следующим образом:
u = u0 - u = QD/kT - u', где
u0 - подвижность в отсутствии электролитов,
u' - электроосмотическая подвижность,
Q - общий заряд частицы,
D - коэффициент диффузии,
k - константа Больцмана и
Т - абсолютная температура.
При этом D может является функцией одного из молекулярных свойств белков.
Ornstein предложил проводить электрофоретическое разделение белков в синтетический гелевой среде на основе полиакриламида (PAGE – polyacrilamide gele electrophoresis). В этом случае D является функцией размера белковой глобулы и разделение белков определяется суммарным зарядом и размером макромолекулярной глобулы белков. Однако в этих условиях белки с различными молекулярными массами могут иметь одинаковую подвижность. Поэтому, не смотря на то, что PAGE может быть применен для разделения и характеристики белковых смесей, этот метод не позволяет разделять белки в соответствии с их молекулярной массой.
1. Полиакриламидный гель.
Основной характеристикой полиакриламидного геля является размер пор, которые образуются при его полимеризации. Этот показатель определяет способность биомакромолекул продвигаться внутри геля в процессе проведения электрофореза. В ходе полимеризации геля происходит винильная полимеризация, приводящая к формированию полимера с хаотически свернутой структурой, который содержит разветвленную сеть пор. Структура такого рода позволяет просеивать макромолекулы с различными размерам.
Для получения полиакриламидного геля используют акриламид и N,N’-метиленбисакриламид (или бис-акриламид), последний из которых отвечает за образование поперечных сшивок в геле.
Размер пор в геле определяется процентным содержанием мономеров (акриламида) (Т%) и количеством сшивающего агента в процентах от общего количества мономеров (С%).
%Т вычисляется по формуле:
%Т = г.(акриламид + бис-акриламид) х 100% / общий объем, мл
Соответственно,
%С = г.(акриламид) х 100% / г.(акриламид + бис-акриламид)
Соотношение между сшивающим агентом и акриламидом является очень важным показателем, так как оно существенно влияет на свойства геля: чем выше концентрация акриламида, тем ниже должна быть концентрация бис-акриламида, и наоборот; одновременное увеличение содержания обоих компонентов приводит к образованию гелей с повышенной жесткостью и хрупкостью, а одновременное снижение – к возрастанию мягкости и эластичности. В настоящее время принято считать, что для разделения макромолекул белковой природы наиболее подходящим является гель со значением %С=2,67% и значением %Т в диапазоне от 7,5% до 20%.
2. Условия влияния на электрофоретическое разделение.
2.1. Влияние соотношений акриламид / бис-акриламид.
Исследование полиакриламидных гелей показало, что размер пор является экспоненциальной функцией от соотношения бис-акриламида к общему количеству акриламида, когда выражено на весовой основе. Более того, экспоненциальная зависимость имеет различные минимумы, когда количество бис-акриламида составляет (достигает) примерно 5%. Диаграмма влияния весового соотношения на величину пор геля схематично представлена на рис. Поскольку кроссшивки образуются случайным образом, размер пор указывается как среднее значение, и индивидуальный размер пор может отличаться в большую или меньшую стороны.
Влияние общей концентрации акриламида:
Morris and Morris изучили поведение (подвижность) группы белков с молекулярной массой от 17,000 до 160,000 различных гелях, отличающимися значениями %Т и %С, то есть где концентрации и соотношения акриламида и бис-акриламида варьировались. При постоянном значении %С изменение подвижности зависит от %Т следующим образом:
ln U/ = ln U0 - KrT (1-1)
U/ / U0 = Ur = e –KrT , (1-2) где
U/ - измеряемая подвижность в экспериментальных условиях,
U0 – определяет подвижность белка при экстраполяции T к нулю,
Kr – постоянная для гелей с постоянной кроссшивкой,
Ur – значение понижения подвижности и
%Т – общая концентрация акриламида в геле, как уже ранее определена.
Из уравнения 1-2 можно сделать достаточно простое заключение: для любого белка, исследуемого на серии гелей с одинаковой кроссшивкой, подвижность макромолекулы уменьшается по экспоненциальной функции Т. Увеличение общей концентрации акриламида приводит к уменьшению размера пор, это означает, что движение макромолекулы затрудняется, и потребуется более продолжительное время для прохождения белка через гель. Чрезмерная кроссшивка может настолько уменьшить размер пор, что достаточно большие молекулы вообще не будут способны проникать и проходить их.
2.2. Механизм полимеризации акриламида.
Полимеризация акриламида инициируется добавлением или генерированием in situ свободных радикалов. Наиболее распространенным инициатором полимеризации акриламида, выступающим в роли источника свободных радикалов являются персульфат аммония. При восстановлении в процессе двухэлектронной реакции, персульфат превращается в сульфат:
S2O82- + 2ē → 2SO42+ Ε0 = 2.01B
Персульфат также может подвергаться и одноэлектронному восстановлению:
S2O82- + 1ē → SO42+ + SO4●, где
SO4●- представляет собой свободный радикал, который и запускает полимеризацию.
Восстановление персульфата ускоряется в присутствии N,N’ – tetramethylenediamine (TEMED), который имеет следующую структуру:
(H3C)2-N-CH2-CH2-N-(CH3)2
Таким образом, персульфат выступает в роли инициатора (I) полимеризации мономера (М) по механизму свободнорадикальной реакции. В нашем случае процесс, происходящий в растворе акриламида, содержащего инициатор, реакция может быть представлена в следующем виде:
М + I → R●
R● + M → RM●
RM● + nM → RM●n+1
RM●n+1 + RM● → Mn+2,
где точка над буквой обозначает неспаренный электрон, приводящий к образованию свободного радикала. И в случае акриламида рост цепи полимера идет по механизму голова – хвост (head – to – tail):
Поскольку акриламид имеет только одну реакционную группу, образование кроссшивок не происходит. И эта ситуация является неподходящей для электрофореза. Это объясняет необходимость в бифункциональном кроссшивающем реагенте, таком как бис-акриламид.
Когда раствор содержит акриламид, бис-акриламид и инициатор полимеризации, происходит одновременное протекание двух реакций – «head – to – tail» полимеризация и кросспининг.
3. Нативный электрофорез.
Данная разновидность электрофореза разработана для разделения белков, находящихся в нативной неденатурированной форме и разделение белков происходит в соответствии с их зарядом и размером. Условия разделения, включая рН буфера, подбираются в соответствии со свойствами белков, но в большинстве случаев используется рН в диапазоне 8-9, когда большинство белков имеют суммарный отрицательный заряд и двигаются в электрическом поле по направлению к аноду. В большинстве случаев используют гели с Т = 7-10%. Однако в зависимости от задачи концентрация акриламида может варьироваться в широком диапазоне в зависимости от того какова молекулярная масса белков, присутствующих в смеси. Для белков с молекулярной массой от 1000 кДа и выше, проникновение в гель которых затруднено, используют гели с Т = 3-4% и С = 0.1%; для белков с низкой молекулярной массой около 10 кДа, соответственно Т = 15% и С до 1%.
Из преимуществ этого метода необходимо отметить, что разделяемые белки находятся в нативной форме и, например, многие ферменты сохраняют свою ферментативную активность. К недостаткам следует отнести несовершенство разделяющей эффективности нативного электрофореза – фракционирование белков происходит в соответствии с их размером и зарядом. Как следствие, белки с различными молекулярными массами могут иметь одинаковую подвижность.
4. Денатурация белков в присутствии додецилсульфата натрия и определение молекулярной массы биомакромолекул белковой природы.
Для разделения белков в соответствии с их молекулярной массой перед началом электрофореза белковую смесь преинкубируют в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН). Анионый детергент ДСН прочно связывается с большинством белков в соотношении 1.4 мг ДСН /мг белка, при этом суммарный комплекс белок-(ДСН)n приобретает отрицательный заряд (предположительно этот комплекс образуется благодаря взаимодействиям между алкильными (гидрофобными) мотивами детергента и гидрофобными участками белковой поверхности; отрицательно заряженная же часть ДСН экспонирована наружу), кроме того ДСН приводит к разрушению нековалентных связей, приводя к денатурации белков. Дополнительная обработка белков реагентами восстанавливающие дисульфидные связи, такие как 2-меркаптоэтанол или дитиотриэтол (ДТТ), приводит к дальнейшей денатурации белков и разрушению белок-белковых комплексов. В этом случае единственным фактором, который может повлиять на подвижность белков в полиакриламидном геле является размер белка, а точнее его молекулярная масса. Подвижность белок-(ДСН)n обратно пропорционально логарифму молекулярной массы: низкомолекулярные комплексы движутся быстрее, чем высокомолекулярные. Это означает, что молекулярная масса белков может быть определена по относительной подвижности белка в геле, а наличие одной полосы в такой геле может являться хорошим критерием чистоты препарата.
Детальные исследования Weber и Osborn показали, что подвижность белков в большинстве случаев находится в четкой зависимости от их молекулярной массы, что позволило применить метод электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН (в английском варианте sodium dodecyl sulfate или SDS) для достаточно точного определения молекулярной массы белков и пептидов. В зарубежной литературе этот метод был назван SDS-poliacrylamide gel electrophoresis или SDS-PAGE.
5. Краткое описание подготовки и проведения электрофореза.
Для получения раствора разделяющего геля смешивают его компоненты. Перед добавлением персульфата из раствора удаляют под вакуумом воздух, так как, во-первых, даже следы молекулярного кислорода подавляют процесс полимеризации и, во-вторых, в результате образования тепла во время электрофореза другие газы, присутствующие в геле, выделяются в виде пузырьков и искажают условия проведения опыта. После добавления персульфата раствор геля заливают между пластинками и сверху аккуратно наслаивают воду, которая препятствует образованию мениска, то есть искривлению поверхности геля, и одновременно мешает доступу атмосферного кислорода, тормозящего полимеризацию. Для устранения влияния кислорода гель даже помещают в атмосферу азота. Полимеризация обычно начинается через 20 минут и заканчивается через 45 минут. После этого воду с поверхности геля тщательно отсасывают при помощи пипетки или шприца с иглой, а остатки воды удаляют фильтриком из фильтровальной бумаги или целлюлозно-ацетатной пленки. Далее поверхность разделяющего геля ополаскивают небольшим количеством раствора концентрирующего геля, который наливают между пластинок и вставляют гребенку, которая создает лунки для нанесения образцов. Полимеризация начинается примерно через 5 минут, о чем свидетельствует появление опалесценции. По окончании полимеризации гель помещают в электрофорезную ячейку, в которую добавляют электродный буфер. Далее гребенку удаляют и в полученные лунки наносят исследуемую пробу. Электрофорезную ячейку подключают к источнику тока.
Экспериментальная часть:
Приготовление стоковых растворов для приготовления электрофорезного геля.
1. Раствор акриламид/бис-аккриламидного раствора (30,8%Т 2,7%С):
Приготовить навеску содержащую 60 г акриламида и 1,6 г бисакриламида. Растворить в 200 мл деионизованной воды. Возможно, для растворения раствор придется нагреть до 40-600 С, периодически перемешивая.
Полученный раствор хранить не более 3-х месяцев при 40 С в темноте.
2. 4Х буфер для разделяющего геля (1,5 М Tris-HCl, pH 8.8):
Приготовить навеску 36,3 г Tris и растворить ее в 150 мл дийонизованной воды. Довести pH полученного раствора с помощью концентрированной соляной кислоты до значения 8.8. После этого довести объем полученного раствора до 200 мл.
Полученный раствор хранить не более 3-х месяцев при 40 С в темноте.
3. 4Х буфер для концентрирующего геля (0,5 М Tris-HCl, pH 6.8):
Приготовить навеску 3 г. Tris и растворить ее в 40 мл деионизованной воды. Довести pH полученного раствора с помощью концентрированной соляной кислоты до значения 6.8. После этого довести объем полученного раствора до 50мл.
Полученный раствор хранить не более 3-х месяцев при 40С в темноте.
4. 10% SDS (додецилсульфа натрия, ДСН):
Приготовить навеску 10 г. SDS и растворить ее в 100 мл деионизованной воды.
Полученный раствор хранить не более 6-х месяцев при комнатной температуре.
5. 10% раствор PSA (персульфата аммония):
Приготовить навеску 0,1 г персульфата аммония и растворить ее в 1 мл деионизованной воды.
Полученный раствор использовать немедленно сразу после приготовления.
6. 2Х буфер для образцов (0,125 М Tris-HCl pH 6.8, 4% SDS, 20% v/v глицерин, 0,2 М ДТТ, 0,02% бромфеноловый синий, pH 6.8):
Приготовить раствор, содержащий:
-
2,5 мл 4Х кратного буфера для концентрирующего геля Tris-HCl, pH 6.8.
-
-
-
2 мг бромфенолового голубого.
-
Довести объем полученной смеси дийонизованной водой до 10 мл.
Буфер хранить при -200С не более 6 месяцев.
7. Электродный буфер (0.025М Tris-HCl, 0.192М Глицин, 0.1% ДСН, pH 8.3):
Приготовить навеску содержащую 30,28 г. Tris, 144,13 г. глицина и 10 г. SDS и растворить ее в 8 л деионизованной воды. Довести pH полученного раствора с помощью концентрированной соляной кислоты до значения 8.3. После этого довести объем полученного раствора до 10 л.
Полученный раствор хранить не более 1-го месяца при комнатной температуре.
Приготовление геля для вертикальной электрофорезной ячейки фирмы «Хеликон»:
I. Подготовка стеклянных пластин для заливки электрофорезнного геля.
1. Для приготовления электрофорезного геля выбурите две стеклянные пластинки - с вырезом и без выреза. Поместите стеклянную пластинку с вырезом на ровную горизонтальную поверхность и поместите по ее краям два спейсера. Сверху положите на спейсеры стеклянную пластинку без выреза. Осторожно переместите стеклянные пластинке в вертикальное положение и поставьте на горизонтальную поверхность. Обратите внимание, чтобы отсутствовал зазор между спейсерами и горизонтальной поверхностью. С помощью зажимов зафиксируйте стеклянные пластинки с находящимися между ними спейсерами.
2. Расплавьте агар и нанесите его тонким слоем на заливочном столике.
3. Поместите зафиксированные стеклянные пластинки с находящимися между ними спейсерами на заливочный столик таким образом, чтобы расплавленный агар находился между стеклянными пластинами. Выждите 10-15 минут пока агар застынет.
II. Приготовление геля.
1. Для приготовления разделяющего геля смешайте компоненты (за исключением ТЕМЕД и PSA) в соответствии с данными приведенными в таблице (толщина геля и концентрация геля). Полученную смесь тщательно перемешайте.
2. Добавьте последовательно ТЕМЕД и PSA и тщательно перемешайте полученный раствор - важно, чтобы в процессе перемешивания не образовались пузырьки с газом.
3. Полученный раствор разделяющего геля поместите находился между стеклянными пластинами так, чтобы уровень не превышал 3 см от верхнего края пластин.
4. Осторожно наслоите на раствор разделяющего геля тонкий слой метанола или деионизованной воды и оставьте гель застывать (до 20 минут).
5. Приготовьте раствор концентрирующего геля как указано в таблице 2.
6. Удалите слой метанола или воды с поверхности застывшего разделяющего геля.
7. Наслоите на поверхность застывшего разделяющего геля раствор концентрирующего геля и немедленно после этого вставьте гребенку между стеклянными пластинами.
8. Оставьте гель застывать в течение (до 20 минут).
III. Подготовка электрофорезной камеры.
1. Поставьте электрофорезную камеру на ровную горизонтальную поверхность.
2. Удалите пластины с гелем с заливочного столика и закрепите их в электрофорезной камере.
3. Добавьте электродный буфер в нижнюю и верхнюю часть электрофорезной камеры так, чтобы уровень электродного буфера на 0,5 см был выше уровня геля.
4. Осторожно удалите гребенку и промойте лунки электродным буфером с помощью шприца.
IV. Нанесение образцов и проведение электрофореза.
1. Подготовьте образцы растворов белков и смешайте их с 2Х буфером для образцов в соотношении 1:1.
2. Прокипятите полученные образцы в водяной бане 2-5 мин.
3. Охладите образцы до комнатной температуры (лучше вообще поставить в лед), после чего слегка крутаните на центрифуге (чтобы снять конденсат с крышки и стенок).
4. С помощью дозатора нанесите полученные образцы в лунки, образованные с помощью гребенки.
5. Подключите электрофорезную камеру к источнику тока.
6. Электрофорез проводится при постоянном токе - 20 мА для одного геля и 40 мА для двух гелей. В этих условиях гель проходит за 40-50 минут.
7. По достижению краской нижнего края геля отключите ток.
8. Удалите пластинки с гелем из электрофорезной камеры.
9. Осторожно выньте спейсеры, находящиеся между стеклянными пластинками.
10. Отделите гель от стеклянных пластинок.
Окрашивание электрофорезного геля с помощью Кумасси ярко голубого (чувствительность 0,3-1,0 μг белка).
Стандартные растворы:
1. Раствор для окрашивания (0,025% Кумасси ярко голубой R 250, 40% метанол, 7% уксусная кислота).
Растворите в 800 мл метанола 0,5 г Кумасси ярко голубого R 250. После этого добавьте к полученному раствору 140 мл уксусной кислоты и доведите объем смеси до 2 литров с помощью деионизованной воды.
Раствор хранится при комнатной температуре не более 6 месяцев.
2. Раствор для проявления 1. (40% метанол, 7% уксусная кислота)
Смешайте 400 мл метанола с 70 мл уксусной кислоты и доведите объем смеси до 1 литра с помощью деионизованной воды.
Раствор хранится при комнатной температуре.
3. Раствор для проявления 2. (5% метанол, 7% уксусная кислота).
Смешайте 500 мл метанола с 700 мл уксусной кислоты и доведите объем смеси до 10 литров с помощью деионизованной воды.
Раствор хранится при комнатной температуре.
Последовательность окрашивания геля с помощью Кумасси ярко голубого R 250:
|
