FAQ по MGISEQ – ответы на часто задаваемые вопросы

ПОДГОТОВКА БИБЛИОТЕК

Сколько баркодов есть у MGI?
96. В каждый набор для подготовки библиотек для 16 образцов входит 16 баркодов, для 96 образцов – 96 баркодов. Кроме того, есть отдельный набор с 96 баркодами.

Какова длина баркодов?
10 нуклеотидов (нт).

Возможно ли двойное баркодирование?
Да, возможно, начиная с конца лета 2019 г. Будут доступны следующие варианты баркодов:
1. 96 баркодов + 96 баркодов
2. 96 баркодов + UMI (Unique molecular index) для индивидуального мечения каждого фрагмента библиотеки перед линейной амплификацией
3. UMI + UDI (Unique dual index) для исключения перескакивания индексов (index hopping)

Какова длина адаптеров?
25 нт.

Известна ли последовательность адаптеров и праймеров для секвенирования?
Да, за информацией можно обратиться к менеджеру Компании Хеликон.

Какая минимальная длина фрагментов должна быть, чтобы смогла сформироваться кольцевая молекула ДНК?
Минимально – около 100 нт. Оптимальная длина – 300-450 нт.

Какова максимально возможная длина фрагментов библиотеки?
Теоретически верхний предел не ограничен. Сейчас в разработке находится химия на одноконцевые прочтения длиной 800 нт. Т.к. клональная амплификация происходит в пробирке, а не на ячейке (как, например, у Illumina (принцип Golden gate)), нет риска, что слишком длинный фрагмент перекинется на соседний кластер и произойдёт наложение сигналов.

Сколько копий фрагментов исходной библиотеки содержится в одном конкатемере (наношарике)?
В среднем, 300-500 копий.

Какова суммарная длины одного конкатемера (ДНК в одном наношарике)?
В среднем, 150 000 – 220 000 нт.

Случайным ли образом схлопывается «наношарик» ДНК при изменении рН и ионной силы?
Нет, наношарики схлопываются за счет частичной комплементарности адаптерных последовательностей (вырожденный палиндром).

Можно ли использовать наборы сторонних производителей для таргетного обогащения перед секвенированием на приборах MGISEQ?
Да, можно использовать гибридизационные панели сторонних производителей (Agilent, Roche, Illumina Nextera, New England Biolabs, и другие).

Можно ли использовать панели AmpliSeq на приборах MGISEQ?
Да, если изначально выделять таргетные участки с помощью праймеров AmpliSeq. Далее к таргетным фрагментам лигируются адаптеры MGI, затем следует стандартная пробоподготовка библиотек MGI.

ТЕХНОЛОГИЯ СЕКВЕНИРОВАНИЯ

Чем технология секвенирования от MGI (cPAS) отличается от технологии Complete Genomics (cPAL)?
Технология секвенирования cPAL (Combinatorial Probe-Anchor Ligation) от Complete Genomics подразумевает последовательную гибридизацию и лигирование олигонуклеотидных проб с одной, а затем с другой стороны от адаптерных последовательностей. В пробе один из нуклеотидов специфичный, а все остальные – универсальной специфичности. Каждая проба мечена флуоресцентным красителем. После присоединения первой пробы вслед за адаптером, лишние пробы отмываются, и фиксируется сигнал. Далее инкорпорировавшаяся проба удаляется и добавляется следующий пул проб, в которых специфичным является уже другой нуклеотид. Таким образом можно секвенировать до 10 нт с обеих сторон от адаптеров. Суммарная длина прочтений достигает 35 нт. (Подробнее в статье>>).

cPAS (Combinatorial Probe-Anchor Synthesis) у BGI подразумевает последовательное присоединение нуклеотидов с одной стороны от адаптера – до 400 нт. (в перспективе до 800). При этом присоединение специфического нуклеотида и детекция сигнала разделены на два технологических этапа. Детекция встроенного нуклеотида происходит с помощью флуоресцентно меченных моноклональных антител. (Подробнее в статье>>).

Почему лигазный синтез у MGI точнее полимеразного?
Точность лигазного синтеза по своей природе на 3–4 порядка выше, чем полимеразного. Кроме того, в технологиях, использующих меченные нуклеотиды, фермент секвеназа (особая модификация ДНК-полимеразы) в процессе присоединения нуклеотида вынуждена помещать в свой активный центр флуоресцентный краситель, а не только сам нуклеотид. За счет этого точность также падает. У MGI процесс присоединения нуклеотида и мечение разнесены по времени, фермент присоединяет нативный нуклеотид, никакой деформации активного центра не требуется.

Разные олигонуклеотидные пробы добавляются на проточную ячейку последовательно или параллельно?
Все 4 пробы добавляются параллельно. Каждая из четырёх проб несёт свои специфические модификации для высокоаффинной посадки антител.

Антитела добавляются на проточную ячейку последовательно или параллельно?
Все 4 антитела добавляются параллельно.

Сколько флуоресцентных красителей используется при секвенировании на приборах MGI?
DNBSEQ-G400 (MGI-2000) – 4 красителя («четырёхцветная химия»), DNBSEQ-G50 (MGI-200) – 2 красителя («двухцветная химия»).

За счет чего отрезается неспецифический хвост олигонуклеотидной пробы с антителами?
Хвост отрезается ферментативно. Какой именно фермент используется – коммерческая тайна.

Достаточно ли одного специфичного нуклеотида для точной посадки олигонуклеотидов вслед за якорем? Нет ли риска, что вслед за одним олигонуклеотидом сядет второй?
Да, достаточно. Термодинамика процессов такова, что сродство олигонуклеотида, залигированного вслед за якорем гораздо выше, чем у олигонуклеотидов, севших на матрицу, но не залигировавшихся. Такие олигонуклеотиды отмываются после каждого цикла элонгации цепи.

Разрезается ли длинный конкатемер одиноцепочечной ДНК на фрагменты на ячейке перед секвенированием?
Нет, достройка комплементарной цепи в процессе секвенирования не предполагает фрагментации цепочки ДНК «наношарика».

У DNBSEQ-G400 (MGI-2000) очень высокая производительность, можно ли как-то оптимизировать запуск при небольшом количестве образцов?
Да, в апреле 2019 в продажу вышла проточная ячейка FCS – 2 дорожки, 112,5 Гб данных за один запуск (225 Гб при запуске двух ячеек одновременно).

Какие особенности технологии позволяют успешно секвенировать на приборах MGISEQ гомополимерные и GC-богатые участки?

• При подготовке библиотек используется полимераза phi29. Её точность на 2 порядка выше, чем у Taq-полимеразы;
• У MGI на каждом цикле секвенирования к матрице присоединяется олигонуклеотид. Два нуклеотида не могут за один цикл присоединиться к матрице (в отличие, например, от полупроводникового секвенирования);
• Секвенирование проходит при 51°С. При такой температуре шпильки, образуемые в гомополимерных участках, и G-квартеты менее термодинамически стабильны, чем двуцепочечный гибрид матрицы и пробы;
• Если полимераза phi29 где-то ошиблась при линейной амплификации, то при секвенировании неправильный сигнал не будет виден на фоне сотен правильных.

Как происходит синтез обратной цепи при секвенировании в режиме парноконцевых прочтений?
После секвенирования ДНК с одного конца, на ячейку добавляются нуклеотиды и ДНК-полимераза phi29, инициирующая амплификацию с множественным вытеснением цепи (Multiple displacement amplification, MDA). Свойства полимеразы phi29 позволяют проводить достраивание цепей ДНК на исходной и всех дочерних цепях одновременно. За счет этого значительно сокращается время на синтез второй цепи. После MDA-реакции к наношарикам добавляются обратные праймеры и проводится секвенирование обратной цепи ДНК. Подробнее – в статье>>.

ТЕХНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПРИБОРОВ

Какие режимы и длины прочтений доступны для секвенаторов DNBSEQ-G400 (MGISEQ-2000)?
Одноконцевые (SE): SE50, SE100, SE400
Парноконцевые (PE): PE50, PE100, PE150, PE200

Какие режимы и длины прочтений доступны для секвенаторов DNBSEQ-G50 (MGISEQ-200)?
Одноконцевые (SE): SE50, SE100
Парноконцевые (PE): PE50, PE100

Возможно ли асимметричное секвенирование (например, в одну сторону 200 нт., в другую 100 нт.)?
Да, возможно. Пока программное обеспечение прибора позволяет задавать пользовательские настройки длины прочтений.

Каков формат выходных данных секвенирования?
FASTQ

Сколько геномов можно секвенировать одновременно на DNBSEQ-G400 (MGISEQ-2000)?
8 геномов с покрытием ≈ 38–40х (1 геном на одну дорожку ячейки FCL (1 ячейка – 4 дорожки, 2 ячейки за запуск).

Необходимо ли подключать секвенаторы MGISEQ к интернету в процессе секвенирования или передачи данных?
Нет, прибор может работать в автономном (stand-alone) режиме, подключение к облаку не требуется.

Какова внутренняя память приборов MGISEQ?
5 прогонов. За счет этого возможна работа в автономном (stand-alone) режиме.

Есть ли протоколы для наборов реагентов и инструкции к приборам MGISEQ?
Да, есть, обратитесь к сотрудникам Компании Хеликон.

Нужен ли для работы с секвенаторами MGISEQ специальный компьютер?
Нет, все настройки проводятся на сенсорном экране прибора. Для анализа данных подойдёт любой стандартный компьютер. Для инсталляции прибора сервисным инженером потребуются клавиатура и мышь.

Есть ли специфические требования к помещению, в котором планируется установка секвенатора MGISEQ?
Да, есть, в частности к температуре помещения (19-25°C). Если есть риск превышения температуры помещения, необходимо установить кондиционер, Полный предустановочный лист можно запросить у менеджеров Компании Хеликон.

ПРИЛОЖЕНИЯ

Подходят ли секвенаторы MGISEQ для анализа метагенома?
Да, в апреле 2019 в продажу вышла реагентика для секвенирования в режиме одноконцевых прочтений длиной 400 нт.

Есть ли опубликованные статьи с использованием приборов MGI?
Есть большое количество статей с предыдущими версиями приборов (BGI-500)>>

Препринты первых статей с моделями приборов DNBSEQ-G400 (MGISEQ-2000) здесь:
1. Сравнение DNBSEQ-G400 (MGISEQ-2000) с HiSeq 2500 по полногеномному секвенированию>>
2. Сравнение DNBSEQ-G400 (MGISEQ-2000) с NextSeq 550 и NovaSeq 6000 по секвенированию транскриптома (RNA-Seq)>>

Есть ли опубликованные статьи по сравнению секвенаторов MGI и Illumina?
Да, первые статьи ждут публикации. С препринтами можно ознакомиться здесь:
1. Сравнение DNBSEQ-G400 (MGISEQ-2000) с HiSeq 2500 по полногеномному секвенированию>>
2. Сравнение DNBSEQ-G400 (MGISEQ-2000) с NextSeq 550 и NovaSeq 6000 по секвенированию транскриптома (RNA-Seq)>>

Смотрел ли кто-нибудь уже анализ транскриптома на MGISEQ?
Да, есть статья по сравнению DNBSEQ-G400 (MGISEQ-2000) с NextSeq и NovaSeq по секвенированию транскриптома>>

ОБЩИЕ ВОПРОСЫ

Есть ли в России уже приборы MGISEQ?
Да, есть, DNBSEQ-G50 (MGISEQ-200) в НИИ фтизиопульмонологии (г. Москва), DNBSEQ-G400 (MGISEQ-2000) в РГМУ им. Пирогова (г. Москва).

Где в мире уже стоят секвенаторы MGISEQ, помимо Китая?
США – несколько (в центре Complete Genomics), Германия (≈2 шт.), Австралия (≈10 шт.), Япония (≈3 шт.), Россия (2 шт.)

Имеется ли реагентика MGI на складе Компании Хеликон?
Да, всегда в наличии наборы для подготовки геномных и экзомных библиотек, баркоды и наборы для запуска секвенаторов.

Планирует ли Компания Хеликон осуществлять услуги по NGS-секвенированию на MGISEQ?
Проведение коммерческого секвенирования в демо-лаборатории Компании Хеликон пока не планируется. Услуги NGS-секвенирования на MGISEQ предоставляются лабораторией в РГМУ им. Пирогова.

Можно ли будет прогнать свои образцы на приборах MGISEQ?
Да, на DNBSEQ-G400 (MGISEQ-2000) в РГМУ им. Пирогова, начиная с апреля 2019.

Планируется ли получение Регистрационного Удостоверения на приборы?
Да.

Планирует ли MGI выпуск новых моделей секвенаторов?
Да. В конце 2019 года в продажу выходит самый производительный прибор MGISEQ-T7 (по производительности аналог NovaSeq 6000, Illumina). Прибор сможет за 24 часа выдавать 1-6 Тб данных (длины прочтений PE100-150, одновременно можно запускать до 4 ячеек). Стоимость прибора составит около 2 млн $, цена за 1 Гб данных – около 16$. Химия – 4-х-цветная. Видео-презентацию прибора можно посмотреть тут.

---

Мы постоянно пополняем список часто задаваемых вопросов. Если вы не нашли ответ на ваш вопрос в нашем перечне, пожалуйста, напишите нам на адрес электронной почты mail@helicon.ru или позвоните по телефону +7 499 705-50-50. Мы с радостью разберёмся в технологии MGI вместе с вами.

Возврат к списку