Хеликон
Кутузовский проспект, 88 121374 Россия, Москва
+7 (499) 705-50-50, +7 (499) 705-50-50, mail@helicon.ru

06

дек

Просто о сложном: технология секвенирования cPAS

Технология секвенирования, используемая в приборах BGI, разработана американской компанией Complete Genomics. Она является одним из методов секвенирования путем синтеза, но имеет ряд особенностей, позволяющих достичь точности прочтений до 99,9%, значительно снизить стоимость одного анализа и существенно сократить время секвенирования.

Технологический процесс можно условно разделить на 3 этапа:

  • Фрагментация ДНК
  • Репарация концов
  • Лигирование адаптеров
  • Амплификация
  • Циркуляризация
   

  • Создание наношариков ДНК
  • Загрузка наношариков на проточную ячейку

  • Встраивание нуклеотидов
  • Визуализация
  • Анализ

1. Подготовка библиотек

Первым этапом пробоподготовки является фрагментация ДНК до последовательностей длиной около 500 п.н. Ее можно проводить с помощью ультразвука или ферментов. После репарации концов ДНК, к фрагментам добавляются специальные адаптеры. Данные адаптеры комплементарны двум участкам олигонуклеотида, который добавляется в реакцию на следующем этапе. Добавление такого олигонуклеотида приводит к циркуляризации исходного фрагмента ДНК, а сам олигонуклеотид служит затравкой при последующей репликации по типу катящегося кольца (амплификация с множественным вытеснением цепи) (рис.1).

Добавление олигонуклеотида Циркуляризация Достраивание цепи ДНК Амплификация по типу «катящегося кольца»

Рис. 1

Подобный тип клональной амплификации хорош тем, что матрицей в каждом цикле служит исходный фрагмент ДНК. За счет этого исключается аккумулирование ошибок ДНК-полимеразы в ходе ПЦР.

2. Формирование наношариков ДНК

Амплификацию проводят до тех пор, пока количество копий исходной матрицы не достигнет трехсот-пятисот. Благодаря запатентованной структуре олигонуклеотидов и адаптеров длинная цепь ДНК укладывается в компактную структуру, так называемый наношарик (DNA nanoball, DNB) (рис.2)


Рис. 2

Формирование наношарика необходимо для многократного увеличения интенсивности флуоресцентного сигнала от одной точки при последующем секвенировании.

Наглядное видео технологии формирования наношариков:

Полученную библиотеку фрагментов ДНК в виде наношариков наносят на специальную проточную ячейку (рис.3)


Рис. 3


В зависимости от модели секвенатора проточные ячейки (Flow Cell, FC) (рис.4) могут состоять из одной, двух или четырех дорожек. Каждая дорожка несет заряженные участки, к которым за счет электростатических сил присоединяются наношарики. Расстояние между заряженными участками рассчитаны таким образом, что к каждому участку присоединяется один наношарик. Проточная ячейка содержит несколько миллиардов заряженных участков; на практике наношариками заполняются около 90% из них.

Поточная ячейка легко заполняется вручную, нет необходимости использовать автоматическую станцию пробоподготовки.


Рис. 4

3. Секвенирование по принципу cPAS (рис.5)


Рис. 5

cPAS (Combinatorial Probe-Anchor Synthesis) – модифицированный вариант метода секвенирования cPAL (Combinatorial Probe-Anchor Ligation), разработанный компанией Complete Genomics. В нем сочетаются методы секвенирования путём гибридизации и путем лигирования.

На первом этапе к наношарикам добавляется праймер для секвенирования (якорная последовательность, якорь). Он присоединяется к адаптерной последовательности на ДНК наношарика. Далее в реакцию добавляется четыре вида проб. Каждая проба состоит из модифицированных нуклеотидов универсальной специфичности (позволяющие связаться с любым из нуклеотидов матричной ДНК), а также одного специфичного нуклеотида (A, T, G или С) на 5’-конце. Каждая из четырех проб мечена индивидуальным* флуоресцентным красителем. Специфичности одного нуклеотида A, T, G или С хватает для однозначного присоединения всей пробы на последовательность, примыкающую к якорному адаптеру. После гибридизации происходит лигирование специфичного нуклеотида с растущей цепью ДНК, а лишние пробы удаляются из реакции. Флуорофорная метка на присоединившейся пробе возбуждается лазером, и сигнал детектируется CDD-камерой. После детекции нуклеотиды универсальной специфичности отщепляются, и проточная ячейка промывается.

При повторении циклов гибридизации-лигирования происходит секвенирование исходной цепи ДНК (одноконцевое прочтение, SE).

В зависимости от необходимой длины прочтений можно проводить от 50 до 150 циклов (режимы SE50, SE100, SE150).

Если необходимы парноконцевые (PE) прочтения, проводится синтез обратной цепи ДНК. К наношарику добавляются нуклеотиды и ДНК-полимераза phi29, инициирующая амплификацию с множественным вытеснением цепи (MDA) (рис.6). За счет этого значительно сокращается время на синтез второй цепи. Свойства полимеразы phi29 позволяют проводить достраивание цепей ДНК на исходной и всех дочерних цепях одновременно.


Рис. 6

После MDA-реакции к наношарикам добавляются обратные праймеры и проводится секвенирование обратной цепи ДНК.

В случае, если образцы баркодированы, после секвенирования обратной цепи ДНК к наношарикам добавляются праймеры для баркодов и проводится дополнительно 10 циклов гибридизации-лигирования.

Полученные в итоге данные имеют стандартный формат FASTQ и BAM, что позволяет анализировать их в привычных биоинформатических программах.

Технология секвенирования, используемая в приборах BGI, уникальна по своей точности и позволяет не только получать данные высочайшего качества, но также экономить время и бюджет.

На данный момент на российском рынке представлено два геномных секвенатора BGI – DNBSEQ-G50 (MGISEQ-200) и DNBSEQ-G400 (MGISEQ-2000) с производительностью 60 Гб и 1080 Гб за запуск, соответственно. В конце 2018 года был анонсирован ещё более производительный прибор – MGISEQ-T7 (до 6 Tб данных за запуск).

Основные приложения секвенаторов BGI:

  • Геномное и экзомное секвенирование;
  • Секвенирование de novo;
  • Метагеномика;
  • Таргетное секвенирование.

Для получения дополнительной информации по технологии, приборам, а также расходным материалам и реагентам для пробоподготовки вы можете написать на электронную почту mail@helicon.ru.


* Количество флуоресцентных красителей на пробах зависит от типа реагентов. В секвенаторе DNBSEQ-G400 (MGISEQ-2000) используется четырехцветная химия (каждый из четырех олигонуклеотидов мечен индивидуальным флуорофором), в DNBSEQ-G50 (MGISEQ-200) – двухцветная (два из четырех олигонуклеотидов мечены индивидуальными флуорофорами, третий мечен сразу двумя красителями, четвертый не несет метки).

Возврат к списку

Подпишитесь и получайте дополнительные скидки